Genética

Terapia gênica: Panorama geral

Antes de falarmos sobre terapia gênica, devemos mencionar Edward Tatum, que ainda em 1966 foi o primeiro a discutir a possibilidade de substituir genes defeituosos por genes funcionais para tratar doenças genéticas. Dois anos depois, Rogers e colaboradores tentaram o primeiro ensaio baseado na terapia gênica. Os autores, para curar mulheres que sofriam de desordens no ciclo da uréia, tentaram substituir o gene defeituoso da arginase pelo seu correspondente funcional, mas os resultados não saíram como o esperado.

Somente em 1989, a terapia gênica ganha força, com o tratamento da primeira doença congênita, nomeadamente severe combined immunodeficience (ADA SCID). Os indivíduos com essa doença têm a imunidade gravemente afetada, devido a deficiência no gene adenosina deaminase (ADA), que codifica para uma enzima disfuncional. Nesse tratamento, foi usado o primeiro protocolo estabelecido de terapia gênica, a abordagem “ex vivo”. 

O tratamento consistiu na remoção de células T de duas crianças afetadas que foram incubadas com um vetor retroviral carregando o gene funcional de ADA. As células T que absorveram o novo gene ADA, foram selecionadas e transplantadas nas crianças. O tratamento foi um sucesso, motivando a comunidade científica a estabelecer novos protocolos de terapia gênica. 

Uma abordagem mais audaciosa surge como “revolucionária” e que garantiria o mesmo sucesso do tratamento anterior. Nesse tratamento feito “in vivo”, um gene da Ornitina transcarbamilase (OTC), funcional, foi injetado diretamente no organismo de um jovem de 18 anos, usando um adenovírus como vetor. A falência múltipla dos órgãos levou a óbito o jovem Jesse Gelsinger. 

Um outro tratamento usando a abordagem “in vivo”, foi feito em 10 crianças que sofriam de imunodeficiência severa combinada ligada ao cromossomo X (SCID- X1), popularmente conhecida como síndrome do “menino bolha”. Trinta meses após o tratamento, duas crianças desenvolveram leucemia, gerando assim dúvidas em relação aos vetores usados em terapia gênica cessando muitas pesquisas relacionadas à terapia gênica. A figura 1 mostra as abordagens “ex vivo” e “in vivo”.

Figura 1: A representação mostra a abordagem “ex vivo” (lado esquerdo), onde as células do doente são removidas, geralmente por biópsia, para serem cultivadas em meio de crescimento e inoculadas com os vetores que transportam o gene terapêutico. Em seguida, as células modificadas são selecionadas e reinjetadas no doente. Na abordagem “in vivo” (lado direito), os vetores com o gene terapêutico são diretamente injetados no organismo do doente. (Adaptado de Kaji and Leiden (2001) (G.M.Azevedo 2019)).

Os caminhos da Terapia Gênica

Após os reveses que decorreram, os ensaios de terapia gênica foram proibidos nos Estados Unidos e União Europeia, fazendo com que a China se tornasse referência em terapia gênica, uma vez que o governo e a Chinese Food and Drug Administration (CFDA) continuaram a apoiar as pesquisas. Dessa forma, a China aprovou os dois primeiros medicamentos baseados na terapia gênica: Gendicine (2003) e Oncorine H101 (2005), ambos restituem a função da proteína p53 para reversão de tumores. 

Estados Unidos e União Europeia só tiveram as pesquisas retomadas a partir de 2012, quando iniciaram estudos com diferentes vetores, capazes de transportar o gene de forma mais eficiente, garantindo não somente a expressão estável do gene a nível nuclear, como também a segurança para evitar efeitos adversos como os mencionados anteriormente. 

É interessante ressaltar aqui que, quando a terapia gênica começou, ela tinha como objetivo o tratamento de doenças monogênicas e após o projeto genoma humano, uma nova perspectiva foi aberta: O tratamento de doenças multigênicas ou multifatoriais.

Por que usar vetores de entrega em terapia gênica?

Devido às propriedades da membrana celular, como as diferenças de cargas elétricas e a permeabilidade seletiva, o material genético (DNA ou RNA) não consegue atravessar facilmente e ainda que o faça, estará sujeito à degradação por enzimas. Assim sendo, o transgene, nesse contexto chamado também de gene terapêutico, é clonado entre sequências nucleotídicas que controlam a expressão desse gene. Nesse ponto, fica claro que a terapia gênica não seria possível sem o uso das técnicas de DNA recombinante. Após o gene terapêutico ter sido recombinado com outra sequência nucleotídica, ele é então inserido em um vetor de entrega.

Terapia gênica e os vetores de entrega

Quando surgiu a ideia de substituir genes defectivos por genes funcionais, ainda em meados da década de 60, surgiu também a questão: Como entregar o gene terapêutico para a célula? Surgiram então estudos para se achar o vetor mais adequado e os vírus se mostraram eficientes. As formas de se atenuar um vírus foram exaustivamente estudadas, para que eles pudessem carregar o gene terapêutico à célula deficiente desse gene. 

Vetores Virais

O modo de atuação dos vírus, tornou-o um vetor natural, com potencial para transferir o gene terapêutico para células específicas. 

O conhecimento prévio sobre o vírus, mostra que: 

  • Para se replicar, o vírus se ancora na membrana da célula e injeta seu material genético na mesma. 

Não demorou para a comunidade científica perceber que bastava, então, colocar o gene terapêutico no vírus para que ele fizesse todo o resto. Mas para usar o vírus como vetor, algumas medidas de segurança precisavam ser tomadas, como por exemplo, atenuar ou eliminar a capacidade virulenta do vírus. Em alguns vírus, a patogenicidade está associada com replicação do mesmo, no interior das células hospedeiras. Eliminando a capacidade de replicação intracelular desse vírus, atenua a capacidade virulenta que ele tem.

Vantagens dos vetores virais

  • A alta especificidade do vírus: O que permite a entrega do transgenes a células específicas; 
  • A capacidade de carregar grandes cargas genéticas: Isso garante uma melhor e mais prolongada expressão do transgene.

Desvantagens dos vetores virais

  • Imunogenicidade: Mesmo com a capacidade virulenta atenuada, alguns pacientes podem sofrer fortes reações imunes quando em contato com componentes do vírus; 
  • Oncogenicidade: O gene viral pode se inserir no genoma do paciente, ativando ou desativando genes específicos.

Vetores não virais

Após os reveses sofridos pela terapia gênica e o uso de vetores virais, o estudo de novos vetores fizeram reacender as perspectivas pelas abordagens terapêuticas e é nesse ponto que os plasmídeos (pDNA) bacterianos entram como uma alternativa mais segura e promissora. Plasmídeos, são moléculas de DNA circular que podem ser clivadas por enzimas de restrição, em locais específicos, para receber o gene terapêutico, originando um plasmídeo recombinante.

O pDNA recombinante pode ser encapsulado por nanopartículas ou associado a algum outro método químico, como por exemplo, lipofectamina que forma um complexo estável com o pDNA, facilitando o transporte da molécula através da membrana plasmática, figura 2.

Figura 2: Representação esquemática do transporte celular do complexo lipofectamine+pDNA, via endocitose. Fonte: (G.M.Azevedo 2019)

Vantagens de vetores não viral

  • Segurança: Considerado mais seguro por não desencadear resposta imune e pela diminuta possibilidade de inserção no genoma do paciente; 
  • Custos: Tem um custo de produção relativamente menor que os vetores virais

Desvantagens de vetores não virais

  • Quebra do plasmídeo: Quanto maior o plasmídeo, mais complicado de se trabalhar, devido às possibilidades de quebra da estrutura durante as etapas laboratoriais de produção e recuperação; 
  • Grau de pureza: O plasmídeo deve estar livre de moléculas oriundas de seus hospedeiros bacterianos, como endotoxinas, proteínas, RNA.
  • Quantidade e isoforma: O plasmídeo deve estar em alta concentração, além do mais, ele deve estar maioritariamente na isoforma super enrolada para uma melhor bioatividade na célula do paciente. 

Nota: Os plasmídeos fazem parte da terceira classe de vetores mais estudados em terapia gênica, atrás dos vetores virais: Adenovírus e retrovírus, respectivamente.

Qual linhagem celular devemos trabalhar em terapia gênica?

  1. Células germinativas
  • Poderia ser uma vantagem inserir genes nas células germinativas, pois teoricamente, esses genes poderiam passar para as células descendentes, corrigindo definitivamente alguma doença de forma permanente. Mas atualmente, a terapia gênica nessa linhagem não é permitida, uma vez que não se conhece os resultados e as consequências reais desse tratamento.
  1. Células somáticas
  • As agências reguladoras, Food and Drug Administration (FDA) e European Medicines Agency (EMA), restringem os tratamentos apenas às células somáticas, por considerarem mais seguros os tratamentos, uma vez que o transgene não se insere no genoma. Dessa forma, a expressão do transgene é transiente, ou seja, irá durar por algum período de tempo.

Conclusão

  • Define-se terapia gênica como a inserção de um gene para substituir outro gene danificado ou mesmo um gene ausente. O gene inserido irá produzir a proteína funcional garantindo a viabilidade celular e tratando a doença em questão;
  • O uso dos vetores baseados em plasmídeo ainda representa uma barreira a ser vencida. Plasmídeos grandes demais, representam um problema, pequenos demais tem uma limitação de doenças a tratar;
  • Obter a isoforma super enrolada e em alta quantidade do plasmídeo e ainda com alto grau de pureza, representa um grande obstáculo a ser vencido.

Referências:

Azevedo Junior, Gilson Martins. Estudo das condições de purificação de DNA plasmídico na sua atividade biológica em terapia do cancro. 2019. 140 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) – Universidade da Beira Interior, Portugal, 2019. 

Alam, T., Wai, P., Held, D., Vakili, S. T. T., Forsberg, E., & Sollinger, H. (2013). Correction of Diabetic Hyperglycemia and Amelioration of Metabolic Anomalies by Minicircle DNA Mediated Glucose-Dependent Hepatic Insulin Production. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0067515

Azevedo, G. M., Valente, J. F. A., Sousa, A., Pedro, A. Q., Pereira, P., Sousa, F., & Queiroz, J. A. (2019). Effect of chromatographic conditions on supercoiled plasmid DNA stability and bioactivity. Applied Sciences (Switzerland). https://doi.org/10.3390/app9235170

Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., & Abedi, M. R. (2018). Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: An update. In Journal of Gene Medicine. https://doi.org/10.1002/jgm.3015

Li, B., Gao, N., Zhang, Z., Chen, Q. M., Li, L. J., & Li, Y. (2017). Historical and clinical experiences of gene therapy for solid cancers in China. In Genes. https://doi.org/10.3390/genes8030085

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